尿路感染是人类服用抗生素的主要原因。在大约 85% 的病例中，它们是由大肠杆菌 （E.） 引起的，而克雷伯菌属、变形杆菌属和肠球菌属是 5-15% 的致病病原体 （1）。复发性尿路感染和连续的抗生素疗程是抗生素耐药性发展的重要驱动因素 （2， 3）。出于这个原因，与长期使用抗生素相比，一些指南更倾向于免疫活性预防来预防复发性尿路感染。
StroVac®（德国汉堡斯特拉斯曼）是一种在德国获得许可的疫苗，用于预防复发性尿路感染。单剂量 0.5 ml 包含 10 种至少 10 种菌株的悬浮液9热灭活细菌：6 种不同的大肠杆菌菌株，以及 1 株奇异变形杆菌、摩根摩根菌、粪肠球菌和肺炎克雷伯菌和磷酸铝作为佐剂 （4）。在临床研究中，它有效减少了女性和男性的复发性尿路感染 （1， 5-8）。一般来说，由于女性尿路的解剖结构及其靠近生殖器官和肛门，女性患复发性尿路感染的风险高于男性。女性和男性的感染风险随着年龄的增长而增加，尤其是男性，年龄是发生尿路感染的危险因素 （9）。
基本免疫包括每隔 2 周肌肉注射 3 次 StroVac®。疫苗的保护期约为 12 个月，此后需要加强剂。Nestler 等人，2021 （1） 比较了基本免疫加一次 StroVac® 加强疫苗接种与预防性使用呋喃妥因三个月。StroVac® 和呋喃妥因在治疗的第一年内都能保护患者免受尿路感染。在第二年，患者显然受益于 StroVac® 疫苗接种：79.3% 的接种疫苗的患者受到保护，不会发生复发性尿路感染，而接受呋喃妥因治疗的患者中只有 59.2% 没有发生尿路感染 （1）。此外，另外两项研究表明，与接种疫苗前 6 个月的间隔相比，在接种 StroVac® 疫苗后的前六个月内，复发性尿路感染患者的药物消耗量大大减少 （6， 10）。
该疫苗被认为通过病原体定向的保护性抗体起作用，即通过适应性免疫系统 （11）。在异源移植受者中，3 剂 StroVac® 未诱导供体特异性自身抗体 （7）。
由于细菌成分可以直接刺激先天免疫系统的受体，从而激活细胞 （12），我们分析了 StroVac® 对吞噬细胞的影响。在这里，我们证明了在没有 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞的情况下这种细菌悬浮液对巨噬细胞的直接影响，这可能是由先天免疫的病原体识别受体 （PRR） 介导的。
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方法
细菌生长曲线
大肠杆菌菌株 455 和 654 在含有 40 g/l 酵母提取物、5 g/l 甘油、3.75 g/l 磷酸二氢钾和 14 g/l 磷酸氢二钠的培养基中在 37°C 下旋转 （150 rpm） 在 0.03-30 mg/l StroVac® 不存在或存在的情况下生长 72 h。在指定的时间点取样，用 PBS 稀释，并通过在血琼脂上定量接种来确定细菌的数量。将血琼脂平板在 37°C 下孵育 24 小时。
细胞分离
从 NMRI 、 C57BL/6 、 C3H/HeJ 或 C3H/HeN 小鼠的股骨制备原代骨髓来源的巨噬细胞 （BMDM），并转移到补充有 4.5 g/l D-葡萄糖和 L-谷氨酰胺的 Dulbecco 最低必需培养基 （DMEM） 中。在 4°C 和 314 x G 下离心 10 分钟后，将沉淀重悬并在含有 54% DMEM 的培养基中培养，其中补充有 4.5 g/l D-葡萄糖、30% 细胞系 L929 细胞培养上清液、10% 热灭活的 FCS、5% 马血清、1% 青霉素加链霉素（10.000 U/ml;10.000 μg/ml）和 0.1% 2-巯基乙醇，在 37°C 下在补充 5% CO 的室内空气中培养 6 天2.在制备后第 7 天，巨噬细胞分化为促 - （M1，添加 0.1 mg/l IFNγ 20 小时）或抗炎（M2，添加 0.001 mg/l IL-4、0.001 mg/l IL-10 和 0.001 mg/l IL-13 20 小时）表型或未分化 （M0） （13）。
小鼠巨噬细胞和单核细胞系 J774A.1 （ATCC 2022） 来源于网状细胞肉瘤，在吞噬作用中具有活性，并在补充有 1 g/l D-葡萄糖、10% 热灭活 FCS 和 100 U/ml 青霉素加 100 μg/ml 链霉素的 DMEM 中培养（Gibco，卡尔斯鲁厄，德国）。
兴奋剂
构成疫苗 StroVac® （≥10 的 10 种细菌菌株9细菌/0.5 ml）（4） 在 65 ± 3°C 下热灭活 90 – 100 分钟（大肠杆菌、奇异变形杆菌、摩根摩根氏菌和肺炎克雷伯菌）或 76 ± 2 °C（粪肠球菌），然后在含有 0.35% 苯酚的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中孵育 4 周，作为灭活和制造过程的一部分。将 21 mg StroVac® 干物质悬浮在 0.5 ml 含有佐剂的碱性悬浮液中。该混悬液中磷酸铝佐剂的浓度为每剂疫苗 1.0 毫克。内毒素浓度为 1470 IU/ml（制造商信息）。全细胞疫苗中的内毒素含量来源于疫苗中掺入的革兰氏阴性菌。StroVac® 的最终浓度为 0.3 至 300 mg/l。细菌的数量与所描述的以毫克为单位的提取物之间没有密切的相关性。单剂疫苗（21 毫克干物质悬浮在 0.5 毫升中）至少含有 109灭活细菌。
假设分布体积为 1 l/kg，则接种疫苗后在人体体内可以达到 0.3 mg/l 的浓度。由于疫苗在体内的分布可能不均匀，因此我们在体外测试了不同浓度的 StroVac®。高于 30 mg/l 的浓度没有定期测试，因为它们在体外诱导细胞毒作用。
从默克公司（达姆施塔特，D）购买的大肠杆菌 O111：B4 的 LPS 作为阳性对照，浓度为 0.01 和 0.1 mg/l （14）。
Toll 样受体激动剂 CpG ODN 1668（5′ TCC ATG ACG ACG TTC CTG CT，分子量 6382.6 g/mol，TIB Molbiol，德国柏林）在吞噬作用实验中用作阳性对照，浓度为 1.0 mg/l （14）。
细胞因子释放和吞噬作用
在补充有 10% 热灭活 FCS （BMDM） 的 RPMI 或含有 1.0 g/l D-葡萄糖并补充 10% 热灭活 FCS 的 DMEM（仅 J774A.1）的 RPMI 中，用 StroVac® 或含有 0.3 至 300 mg/l 的疫苗碱性悬浮液（仅 J774A.1）刺激 96 孔板中每孔 50,000 个 BMDM（M0、M1 或 M2 巨噬细胞）或 J774A.1 细胞 （15）。
为了量化吞噬作用，5x106由德国格赖夫斯瓦尔德大学分子遗传学和感染生物学系 Sven Hammerschmidt 教授友情提供的两种未包膜的致病菌株 （CFU） 大肠杆菌 DH5-α 或肺炎链球菌 （S.） R6 菌落形成单位 （CFU） 大肠杆菌 （16） 与 BMDM 在补充有 10% 热灭活胎牛血清 （FCS） 的 RPMI 培养基 1640 中共孵育 45 分钟。将细菌和 J774A.1 细胞在 DMEM 中与 1.0 g/l D-葡萄糖和补充 10% 热灭活 FCS 的丙酮酸共孵育 45 分钟。此后，将巨噬细胞和细菌在室温下以 314 x G 离心 10 分钟，并使用上清液通过酶联免疫吸附测定法测定细胞因子 TNF-α、IL-6、IL-12/IL-23 p40 和 IL-1β 的浓度（ELISA Deluxe Kits，BioLegend，阿姆斯特丹，荷兰）按照制造商的说明。检测限为 3.9 ng/l （TNF-α 、 IL-6 、 IL-12/IL-23 p40 和 IL-1β ）。使用 150000 个 J774A.1 细胞并通过上清液中乳酸脱氢酶 （LDH） 的浓度并遵循制造商的说明（CytoTox-ONE，Promega，Walldorf，Germany）来确定细胞活力。
用 PBS 洗涤吞噬细胞后，将细菌和真核细胞在含有 10% FCS 和 100 mg/l 庆大霉素的 DMEM 或 RPMI 培养基中共孵育 45 分钟，以杀死细胞外细菌。用 PBS 进行另一次洗涤步骤后，用 100 μl 蒸馏水裂解真核细胞，在 37°C 下孵育 24 小时后，通过在血琼脂上定量接种来确定细胞内（吞噬）细菌的数量。通过计数集落形成单位来确定细胞内细菌的数量。
统计学
为了比较在不同日期进行的吞噬作用实验，将所有数据归一化为相应的对照组。由于在大多数情况下，数据不是正态分布的，因此显示了中位数和第 25/75 个百分位数。在没有 StroVac®（或碱性悬浮液）、LPS（对照）和 CpG（对照）的情况下，吞噬细菌的中位数设置为 100%，在 StroVac®、LPS 和 CpG 存在下吞噬细菌表示为相应对照组中位数的百分比。通过 Kruskal-Wallis 检验比较各组，然后进行 Dunn 多重比较检验以纠正重复检验，α误差≤ 0.05 被认为具有统计学意义。使用单因素方差分析分析 LDH 测定，然后采用 Dunnett 多重比较检验作为后测。
为了评估最大效果（最大吞噬作用以未刺激细胞的吞噬作用的百分比表示，E麦克斯）和引起最大效应的 50% 的浓度 （EC50），使用相应浓度的吞噬作用中位数（以百分比为单位）构建 S 形剂量反应曲线。
所有计算均使用 Graph Pad Prism 版本 6.01（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）进行。
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结果
在没有真核细胞的情况下，StroVac® 的存在不会影响细菌生长（补充图 1）。在 StroVac® 刺激下，原代小鼠巨噬细胞以剂量依赖性方式释放细胞因子 TNF-α、IL-6、IL-12/23 p40 和 IL-1β （图 1A–D).J774A.1 巨噬细胞系响应 StroVac® 的刺激，释放 TNF-α但没有释放大量 IL-6 （图 1E、F).用 StroVac® 或 LPS 刺激后未检测到 IL-12/23 p40 和 IL-1β 的释放（数据未显示）。用碱性悬浮液（包含佐剂和除细菌以外的所有其他成分）刺激 J774A.1 巨噬细胞诱导 TNF-α 的小剂量依赖性释放（补充图 2）。
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图 1
原代小鼠骨髓来源的巨噬细胞（从 C57BL/6 小鼠中分离的 BMDM）释放促炎细胞因子 （A-D;TNF-α：A、IL-1ß：B、IL-6：C、IL-12/IL-23 p40：D）和 J774A.1 巨噬细胞系（E、F;TNF-α：E，IL-6：F）。用不同浓度的灭活细菌疫苗 StroVac® （0.3 mg/l – 30 mg/l） 或 0.1 mg/l LPS 作为阳性对照刺激原代巨噬细胞和 J774A.1 细胞 24 小时。每孔使用 50,000 个细胞。横条表示中位数（4 – 10 个独立实验的 4 – 6 次测量 （*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001， ****p<0.0001;Kruskal-Wallis 检验，然后是 Dunn 多重比较检验）。虚线表示检测限。
在骨髓来源的巨噬细胞中，StroVac® 以剂量依赖性方式刺激大肠杆菌和肺炎链球菌的吞噬作用 （图 2和补充图 3 ）。在原代 M0、M1 和 M2 巨噬细胞中观察到这种吞噬作用的增加，即在巨噬细胞的不同激活状态下 （图 2A-C）和小鼠巨噬细胞系 J774A.1 （图 2D和补充图 3 ）。执行委员会50原代 M0 为 5.12 mg/l，M1 为 1.21 mg/l，M2 细胞为 0.67 mg/l，J774A.1 细胞为 3.56 mg/l。The E麦克斯在原代 M0 中为 673%，在 M1 中为 789%，在 M2 细胞中为 436%，在 J774A.1 细胞中为 1122%。
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图 2
原代小鼠骨髓来源的巨噬细胞（从 C57BL/6 小鼠中分离的 BMDM，A-C）和 J774A.1 巨噬细胞系 （D，E） 对大肠杆菌的吞噬作用。原代巨噬细胞 [未分化 = M0 （A），促炎 = M1 （B），抗炎 = M2 （C）] 和 J774A.1 细胞 （D） 用不同浓度的灭活细菌疫苗 StroVac® （A-D） 或碱性悬浮液 （E） 或 LPS 刺激 24 小时。数据以中位数（第 25/75 个百分位数）表示。每孔使用 50,000 个细胞。每个单独实验中未刺激细胞的中位吞噬作用定义为 100%（来自 3 – 4 个独立实验的 3 – 12 次测量）（*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001， ****p<0.0001;Kruskal-Wallis 检验，然后是 Dunn 多重比较检验）。
细菌吞噬作用的刺激与 StroVac® 的 LPS 含量无关。相当于 3、10 和 30 mg/l StroVac® 的 LPS 含量的 LPS 浓度不会刺激从野生型小鼠中分离的 BMDM 的吞噬作用。此外，LPS 耐受小鼠菌株 C3H/HeJ 的 BMDM 在用 StroVac® 刺激后显示对大肠杆菌的吞噬作用增加，但在用 LPS 刺激后没有。与这些结果一致，与对照相比，从 LPS 敏感小鼠菌株 C3H/HeN 中分离的 BMDM 在用 LPS 刺激后吞噬的细菌明显更多。Toll 样受体激动剂 CpG 作为刺激吞噬作用的阳性对照。结果表明，StroVac® 的细菌成分刺激先天免疫细胞，与 StroVac® 的 LPS 含量无关 （图 3).
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图 3
原代小鼠骨髓来源的巨噬细胞 （BMDM） 对大肠杆菌的吞噬作用。从NMRI（A）、C3H/HeJ（B、C）或C3H/HeN（D、E）小鼠分离的BMDM [未分化=M0（A、B、D），抗炎=M2（C、E）]用不同浓度的灭活细菌疫苗StroVac®刺激，相应StroVac®浓度（0.02-0.2μg/l）或10μg/l LPS的LPS含量作为阳性对照24小时。CpG 用作耐 LPS 小鼠菌株 C3H/HeJ 的 BMDM 的阳性对照。数据以中位数（第 25/75 个百分位数）表示。来自 4 个独立实验的 6 – 2 次测量（*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、Kruskal-Wallis 检验，然后是 Dunn 多重比较检验）。
浓度高达 30 mg/l 时，佐剂不会刺激 J774A.1 巨噬细胞系对细菌的吞噬作用。在 300 mg/l 时，佐剂导致 J774A.1 巨噬细胞的吞噬活性小幅但显着增加（n = 15，增加 207%，p=0.0498，Kruskal-Wallis 检验，然后是 Dunn 多重比较检验）（图 2E).
在细胞培养上清液中测得的 LDH 浓度表明，StroVac® 对浓度高达 10 mg/l 的真核细胞无毒。仅在 30 和 300 mg/l 的 StroVac® 浓度下，检测到细胞培养上清液中 LDH 浓度的增加，这表明疫苗在非常高的浓度下对真核细胞具有毒性，这可能是由于吞噬细胞的过度刺激所致（图 4).
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图 4
StroVac® 对 J774A.1 巨噬细胞的细胞毒作用。将 0.3 – 300 mg/l StroVac® 与 150000 个细胞系 J774A.1 细胞一起孵育 24 小时。测量 LDH 释放并标准化为完全裂解的细胞。完全裂解定义为 100%（3 次测量）（**p<0.01，****p<0.0001;单向方差分析，然后是 Dunnett 多重比较检验）。请注意 StroVac® 对真核细胞的中等毒性（30 mg/l 时）和强毒性（300 mg/l）。
J774A.1 巨噬细胞在 300 mg/l 时不存在吞噬作用是由于 StroVac® 对真核细胞的直接毒性引起的。图 4).在如此高的非生理浓度下，疫苗具有细胞毒作用。接种疫苗后人血浆和其他体液中的浓度比引起体外毒性的浓度低几个数量级。
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讨论
用作预防尿路感染疫苗的灭活细菌混悬液 StroVac® 导致促炎细胞因子的释放呈剂量依赖性增加。
在该实验设置中测量了细胞因子 TNF-α、IL-6、IL-12/IL-23 p40 和 IL-1β，因为它们对于防御细菌感染非常重要：TNF-α 的释放会增加巨噬细胞的吞噬能力 （17）。IL-6 介导先天免疫和适应性免疫，因为它由先天免疫细胞产生，促进 B 淋巴细胞分化为产生免疫球蛋白的细胞，并调节初始 CD4+ T-Zellen 的分化 （18， 19）。此外，它有助于宿主对细菌感染的抵抗力。IL-1ß 可诱导发热、释放促炎分子并刺激先天免疫系统 （20–22）。IL-12 对宿主的感染抵抗性非常重要，并诱导 TH1 细胞的刺激 （23， 24）。IL23 调节 TH17 细胞反应 （25）。
与原代巨噬细胞相比，细胞系 J774A.1 的细胞因子释放相对较低。用 StroVac® 刺激后可检测到 TNF-α 和 IL-6，但 IL-12/IL-23 p40 和 IL-1β 的测量值低于 3.9 pg/ml 的检测限。众所周知，细胞系在表型和基因表达方面与原代细胞不同。由于细胞永生化和反复传代培养，表型可能会发生变化 （26）。
吞噬活性的浓度-响应曲线分析表明 E麦克斯在 C57BL/6 小鼠和 J774A.1 细胞分离的 M0 和 M1 原代巨噬细胞中含量较高，在 M2 原代巨噬细胞中含量相对较低。相反，EC50在 M2 细胞中最低。这与从 8 个健康献血者的体外血液制备的巨噬细胞的行为非常相似：M1 细胞对 FITC 标记的大肠杆菌表现出最高水平的吞噬活性，但在 M0 和 M2 巨噬细胞中也观察到吞噬活性 （27）。
原代巨噬细胞与 StroVac® 孵育诱导促炎细胞因子 TNF-α、IL-6、IL-12/IL-23 p40 和 IL-1β 的浓度依赖性释放。在没有淋巴细胞的情况下，这种刺激作用很可能是由先天免疫系统的激活引起的。在这方面，作为 Toll 样受体 （TLR）-4 配体的脂多糖似乎没有发挥主要作用。在疫苗制备过程中，几乎所有的脂多糖都被热破坏，根据制造商的信息，疫苗中存在的最大浓度的 LPS 在我们的实验环境中并没有刺激真核细胞。此外，StroVac® 刺激 C3H/HeJ BMDM 中的吞噬作用，这些 BMDM 对 LPS 的刺激作用具有抵抗力。因此，这种灭活细菌悬浮液的 LPS 以外的成分强烈刺激了先天免疫系统。免疫细胞可以通过模式识别受体 （PRR） 检测保守的分子特征 [病原体相关分子模式 （PAMP） 或损伤相关分子模式 （DAMPS）] （28）。已经描述了五类不同类别的 PRR：Toll 样受体 （TLR） 和 C 型凝集素受体感应位于细胞外或液泡隔室内的 PAMPS 和 DAMPS。NOD 样受体、AIM2 样受体和视黄酸诱导基因 （RIG）-I 样受体可识别位于细胞质内的 PAMP 和 DAMP。PRR 激活可通过核因子 kB （NFkB） 或干扰素调节因子 （IRF） 通路或通过激活炎性小体（聚集在胞质溶胶中的大分子复合体，从而触发促炎反应）产生促炎反应 （28）。此外，佐剂（如铝盐、皂苷和乳剂）具有触发先天免疫系统以加强信号转换到适应性免疫系统的功能，可以激活炎性小体 （29）。因此，除 LPS 外，StroVac® 的不同成分很可能激活了先天免疫细胞。Elson 等人 2007 （12） 的研究证明，活的和热灭活的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌能够通过不同的先天免疫受体激活细胞。
局部合成的分泌型 IgA 在患有复发性尿路感染的女性中显示较低，这些低抗体水平可能易导致复发性尿路感染 （30）。据报道，这种疫苗的效果是通过增加尿 IgA 的产生来降低复发性尿路感染的频率 （11）。我们的数据表明，在没有淋巴细胞的情况下刺激巨噬细胞，表明先天免疫系统额外激活了吞噬细胞的抗菌能力，这是该疫苗作用的一个组成部分。过去几年已经研究了先天免疫系统的长期记忆。已经表明，先天免疫系统表现出类似记忆的能力，称为“训练有素的先天免疫”（31）。训练有素的先天免疫的这些长期影响是由表观遗传和代谢变化介导的，并可能导致针对相同或不同病原体的长期免疫反应增强 （32， 33）。近年来，已经发表了大量关于疫苗和细菌成分影响的令人信服的数据，例如 BCG 疫苗，它不仅可以预防结核病感染，还可以针对由先天免疫细胞（如单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞）介导的其他感染提供强大的非特异性保护 （34).对活疫苗诱导的异源感染的耐药性可持续长达 5 年。根据研究，训练有素的先天免疫的免疫表型是可追溯的，从 3 个月到一年（由 （33） 总结）。
我们研究的一个局限性是，我们没有分析用 StroVac® 刺激后先天免疫细胞的表型，包括 TLR 表达或先天免疫细胞激活标志物在 RNA 或蛋白质水平上的表达。我们假设训练有素的先天免疫的概念可能涉及 StroVac® 对感染的保护作用，但显然，需要进行体内研究来证明这一假设。我们计划进行体内实验，其中缺乏 B 细胞和 T 细胞的小鼠将用 StroVac® 免疫，然后分析其免疫反应的持续时间和对感染的保护。此外，将在不同时间点从免疫的野生型小鼠中分离巨噬细胞，并分析其抗菌活性和细胞因子产生。研究 StroVac® 对异源感染保护的影响是未来研究的另一个重要目标。已经发表的数据表明，训练有素的先天免疫具有长期保护作用：间隔 4 天两次腹膜内注射 1 毫克 Toll 样受体-2 激动剂酵母聚糖，可保护小鼠免受单核细胞增生李斯特菌感染 9 周 （35）。酵母聚糖或白色念珠菌诱导训练有素的先天免疫可保护受过训练的小鼠的后代免受系统性异源大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌感染 （36）。
总之，StroVac® 不仅通过适应性免疫系统起作用，还通过先天免疫系统起作用。刺激作用对先天免疫系统的确切机制和持续时间仍有待确定。在临床实践中，这种疫苗有助于减少尿路感染中抗生素的消耗，并且可能对由该疫苗中掺入的病原体引起的其他细菌感染有效。因此，它可能有助于减少过度使用抗生素对细菌的进化压力。